近年来，生物医学领域在细胞和基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）方面取得了颇具规模的突破。以anti-CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法在血液瘤的治疗中显示出了显著的效果，同时基于AAV载体的基因疗法为众多罕见病患者提供了新的治疗希望。此外，CRISPR基因编辑技术的进展标志着基因治疗进入了一个崭新的时代，其中体外基因编辑疗法CTX001即将上市，并且体内基因编辑疗法同样展现出良好的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性问题备受瞩目，因为它对基因组DNA的直接影响意味着任何不精确的更改都可能带来长期的潜在风险。因此，FDA等监管机构发布了关于基因治疗安全性的指导原则，主要集中在两大方面：一是基因组完整性的评估，包括染色体重排、大片段的插入或缺失、外源DNA的整合及其可能引发的致癌性；二是脱靶编辑活动的识别，包括类型、频率和位置。

在本文中，我们将详细探讨各种脱靶检测技术。脱靶效应是指在基因编辑过程中，CRISPR-Cas9等工具除针对目标序列进行编辑外，还可能错误地影响其他与目标序列相似的非目标位点，从而导致意外的基因组变化。为了确保基因编辑的安全性和有效性，多个检测方法已经被开发出来，以评估和检测脱靶效应。这些检测方法可以根据实验条件大致分为体内检测和体外检测两大类。

体内检测方法

体内检测方法指在活细胞或生物体内进行脱靶效应的评估，通常更接近真实的生物环境。

GUIDE-Seq

GUIDE-Seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的强大工具。其基本原理是通过向细胞内引入双链寡核苷酸标记物（dsODN），随后利用高通量测序技术识别这些被标记的位点，从而全面识别潜在的脱靶编辑位置。

南宫28NG相信品牌力量，支持GUIDE-Seq的优势在于能够提供全基因组水平的脱靶位点信息，并且直接检测真实的双链断裂事件。然而，其实验操作较为复杂，对于某些难以转染的细胞类型实施时可能存在困难。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）是一种创新方法，通过监测Cas9蛋白与DNA结合位点的变化来揭示潜在的脱靶位点。该方法能在活细胞中直接操作，提供了更为真实的实验条件。

尽管如此，DISCOVER-Seq的实验设计较复杂，需要特定的设备和技术支持，但在安全性评估等多个领域都有广泛的应用前景。

体外检测方法

体外检测方法则是在实验室条件下，通过使用从生物体提取的成分或合成材料进行的测试，这些方法可以对特定因素提供精准的控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种用于全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的高通量测序方法。其原理是通过在体外使用纯化的基因组DNA模拟Cas9核酸酶的切割作用，识别并量化由Cas9造成的双链断裂位点。

该方法的优势在于能够无偏见地鉴定脱靶位点，但需要大量的起始DNA和高级测序设备，且数据分析过程复杂。

WGS全基因组测序

全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）是一种用于确定个体基因组中全部DNA序列的技术。WGS通过将整个基因组分解为小片段进行高通量测序，以识别各种遗传变异。随着第二代测序技术的普及，该方法的成本显著降低，广泛应用于基础科学研究和医学诊断等多个领域。

RNA-seq

RNA测序（RNA-seq）使用高通量测序技术分析转录组，能够提供关于基因表达和转录本结构的详尽信息。RNA-seq在医学、农业科学和生态研究中均有着广泛的应用潜力。

总的来说，CRISPR技术的应用带来了巨大的潜力，同时也伴随着显著的风险，尤其是脱靶现象。本文介绍的各种主流CRISPR脱靶检测方法各具特色，在实际操作中，尤其是临床试验中，需要结合多种检测方法进行全面评估，以降低脱靶风险。我们期待看到更多高效准确的脱靶检测手段问世，进一步提升基因编辑技术的安全性和可靠性。南宫28NG相信品牌力量，致力于为基因编辑技术提供专业的支持和服务。